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Actualidad Covid19

A propósito del diagnóstico de SARS-COV-2 por PCR

D. Jasson Abel Saldarreaga Marín. Especialista en Microbiología y Parasitología Clínica y en Medicina Familiar y Comunitaria. Vocal de Médicos en Precario y de Médicos en Formación del COMCADIZ

CONSIDERACIONES GENERALES.

Empezaremos con una aclaración básica y fundamental: todas las pruebas diagnósticas tienen limitaciones. Si bien es cierto que cuanto más elevadas sean su validez (sensibilidad y especificidad) y su seguridad (valores predictivos), entre otras variables, tendremos menos probabilidad de que el resultado obtenido sea por un error de cualquier índole, o simplemente debido al azar.

Partiendo de esa premisa, para aumentar nuestra confianza en la prueba deberemos recurrir a la utilización de un conjunto de medidas (no solo una) para aumentar nuestras probabilidades de éxito. Actualmente esto se hace mandatorio por el alcance de la situación sanitaria actual.

Actualmente se describen tres estrategias para la detección del coronavirus tipo 2 asociado al síndrome respiratorio agudo severo -a partir de ahora SARS-CoV-2– o la infección asociada a él -a partir de ahora COVID-19-. Todas están bien diferenciadas, cada una con sus ventajas y limitaciones:

– Dos de ellas son directas, pues detectan estructuras del virus, bien material genético vírico (ARN) o bien material proteico (antígenos virales).

– Una tercera detecta de forma indirecta la infección mediante el estudio de la formación de anticuerpos generados en el organismo del huésped infectado (pruebas serológicas).

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA.

Nos vamos a centrar en las pruebas de detección de material genético, mediante la utilización de la PCR (reacción en cadena de la polimerasa, del inglés Polymerase Chain Reaction).

Es de destacar que en muy pocos meses hemos asistido a un rápido desarrollo de ensayos basados en la PCR para la detección de los ácidos nucleicos virales (genoma viral o ARN replicativo, exclusivo de este virus), convirtiéndose en la técnica de diagnóstico preferente utilizada en la clínica y a nivel epidemiológico por todos los países del mundo.

Los análisis con fines diagnósticos de COVID-19 basados en ácidos nucleicos ofrecen la detección del genoma vírico SARS-CoV-2 de forma directa y se considera el método más sensible y temprano de detección de COVID-19.

Las pruebas para la detección de SARS-CoV-2 basadas en la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) se están utilizando para descartar la infección entre personas de alto riesgo, como pacientes hospitalizados expuestos y sanitarios. De hecho, la RT-PCR para detectar ARN del SARS-CoV-2 del tracto respiratorio superior es la prueba de diagnóstico inicial de elección para COVID-19.

La detección de ácidos nucleicos virales permite saber si hay presencia de estos elementos del virus en un momento concreto.

La principal limitación que presenta es que no discrimina en qué momento de la infección nos hallamos, o si se trata de restos virales que ya no son infecciosos. Por ello, se vuelve fundamental tener en cuenta el contexto clínico y epidemiológico de cada caso, pues contribuye notablemente en la interpretación del diagnóstico final. De ahí la importancia de repetir una nueva prueba en aquellos casos dudosos para confirmar los resultados.

Como hemos comentado, el primer diagnóstico con sospecha de infección se realiza por identificación de los ácidos nucleicos virales, recomendándose por tanto la PCR en muestras de fosas nasales/orofaringe, cuyo resultado positivo indica, de forma general, la existencia de infección activa en el paciente.

Adelantamos que la cantidad de partículas virales (la carga viral) detectables mediante PCR es máxima en los primeros 7 días de la infección, aunque también se pueden detectar en fases posteriores.

Debemos apuntar que las RT-PCR cualitativas (las que ofrecen resultado “positivo” o “negativo”), si bien presentan alta sensibilidad, tienen la gran limitación de no discriminar entre carga viral alta (infectiva), cargas virales mínimas o restos de ARN (no replicativo). Esto se traduce en un hecho de crucial importancia para el manejo clínico y epidemiológico del paciente: la detección del genoma viral no es predictivo de si el paciente está en la fase activa de la enfermedad con elevadas cargas virales y alto potencial de transmisión del virus, o si se trata de pacientes que ya no tienen enfermedad clínica, con mínima carga viral (o solo restos de ARN viral) y que no son contagiosos.

SOBRE EL UMBRAL DE CICLO DE LA PCR.

El umbral de ciclo (Ct, del inglés Cycle threshold) se refiere al número de ciclos en un test de RT-PCR necesario para amplificar ARN viral para alcanzar un nivel detectable. Dicho de otra forma: el Ct es el número de ciclos de replicación necesarios para producir una señal fluorescente. Por tanto, el valor de Ct puede indicar el nivel relativo de ARN viral en una muestra de tal forma que valores de Ct más bajos representan cargas de ARN viral más altas.

Un valor de Ct inferior a 40 se informa clínicamente como PCR positivo. El Ct en el que la PCR se considera positiva en España es menor de 30 ciclos. (https://www.mscbs.gob.es/profesionales/saludPublica/ccayes/alertasActual/nCov/documentos/COVID19_Estrategia_vigilancia_y_control_e_indicadores.pdf)

  • Casos leves: en la mayoría de las personas con infección sintomática por COVID-19, el ARN viral en el frotis nasofaríngeo medido por el umbral del ciclo se vuelve detectable desde el primer día sintomático, alcanzando su punto máximo dentro de la primera semana del inicio de los síntomas.  Esta positividad comienza a disminuir en la semana 3 y posteriormente se vuelve indetectable. 
  • En pacientes hospitalizados gravemente enfermos los valores de Ct son inferiores a los valores de Ct de los casos leves, y la positividad de la PCR puede persistir más allá de las 3 semanas posteriores al inicio de la enfermedad, cuando la mayoría de los casos leves darán un resultado negativo. 
  • Limitaciones del Ct:
    • Este valor no se indica por los laboratorios cuando la PCR es cualitativa. 
    • La aplicación clínica de la Ct es incierta. 
    • Los valores de Ct no están estandarizados en las distintas casas comerciales de RT-PCR, por lo que los resultados no se pueden comparar entre diferentes tests. 
    • Todavía no existe un estudio clínico que haya validado el uso de Ct para su utilización en guías de pacientes con COVID-19.

SOBRE LA VALIDEZ.

La validez de una prueba diagnóstica viene determinada por la sensibilidad y la especificidad.

Como resultados falsos negativos entendemos aquellos que en personas infectadas sintomáticas o asintomáticas, no se han detectado, o el test ha sido erróneamente negativo.  Esto se define en laboratorio como sensibilidad del test: probabilidad de clasificar correctamente a un individuo enfermo, es decir, la probabilidad de que para un sujeto enfermo se obtenga en la prueba un resultado positivo. La sensibilidad es, por lo tanto, la capacidad del test para detectar los enfermos.

Por el contrario, se etiquetan de falsos positivos los que darían a una persona como infectada sin estarlo. Así la especificidad del test es la probabilidad de clasificar correctamente a un individuo sano, es decir, la probabilidad de que para un sujeto sano se obtenga un resultado negativo. De esta forma la especificidad se puede definir como la capacidad para detectar a los sanos. 

En general, se puede considerar que la RT-PCR de SARS-CoV-2, atendiendo a todas las publicaciones tiene más de un 98% de seguridad y fiabilidad diagnóstica.

Matizaremos que la precisión y los valores predictivos de las RT-PCR del SARS-CoV-2 no se han evaluado sistemáticamente. Son pruebas muy específicas y con alta sensibilidad analítica en entornos ideales; es decir, pueden detectar con precisión niveles bajos de ARN viral en muestras que se sabe contienen ARN viral.

Sin embargo, el rendimiento clínico es más variable, ya que un aspecto es la capacidad diagnóstica del test, es decir del reactivo, y otra es la capacidad diagnóstica de proceso completo. Éste no está exento de fallos, sobre todo por la complejidad de la fase pre-analítica, que comprende todo el proceso por la que pasa la muestra hasta su procesamiento (desde la toma de muestras, envasado, etiquetado y envío, hasta su transporte, manipulación y conservación, entre otras). De hecho, el 70% de los errores del laboratorio se producen en la fase pre-analítica.

FALSOS POSITIVOS.

En relación a los resultados falsos positivos, se producen con poca frecuencia, pero se han informado en hasta un 3% de los casos. Suelen ocurrir por errores en el proceso analítico, pues nos solemos encontrar con una metodología poco automatizada y con mucha manipulación e intervención del personal. Entre las causas más frecuentes nos encontramos:

  • Contaminación de una muestra positiva analizada al mismo tiempo con otra negativa: contaminación cruzada.
  • Amplificación de genes de muestras positivas anteriores o controles positivo: contaminación por arrastre.
  • Aparición de errores aleatorios incluso con los controles en rango.
  • La amplificación de los ácidos nucleicos hace que los ensayos basados en PCR sean muy sensibles, pero también muy vulnerables a niveles ínfimos de contaminación de la muestra, que pueden ocasionar resultados falsamente positivos.

FALSOS NEGATIVOS.

Las tasas de falsos negativos notificados han oscilado entre menos del 5% y el 40%, aunque estas estimaciones son limitadas, en parte porque no existe un estándar de referencia perfecto para la comparación.

Un porcentaje variable de pacientes puede dar resultados negativos aun estando infectados, debido a distintos factores asociados con la dinámica de la carga viral y con la obtención y procesamiento de la muestra. Por ello, es recomendable la combinación con pruebas serológicas, así como la realización de PCR seriadas en caso de clínica compatible:

  • Si la prueba inicial es negativa pero persiste la sospecha de COVID-19 y es prioritario confirmar la presencia de infección para su manejo o control, se recomienda repetir la prueba entre 24 y 48horas tras la prueba inicial.
  • Para los pacientes que presentan PCR negativa a las 3-4 semanas de evolución se recomienda realizar serología, especialmente IgG; un resultado positivo sugeriría COVID-19, mientras que una prueba negativa podría sugerir una disminución de la probabilidad.

La existencia de falsos negativos puede explicarse en parte por la cinética errática del virus y por la heterogeneidad de cada paciente a lo largo de la historia natural de la infección, principalmente cuando estas determinaciones se obtienen de muestras rinofaríngeas de pacientes leves (Wölfel et al). Este comportamiento puede ayudarnos a entender la alternancia de resultados positivos y negativos a lo largo de la evolución de un mismo paciente infectado por SARS-CoV-2.

Hay estudios publicados donde se recoge que pacientes a los que se les repitió la prueba de RT-PCR nasofaríngea a los siete días de una prueba inicial negativa, presentaron hasta el 3.5% de las pruebas repetidas como positivas. De hecho, muestran que la sensibilidad de la PCR es del 82.2% (cuando se hace análisis de forma retrospectiva de suero de pacientes con sospecha clínica y tests previos de PCR negativos), y que asciende al 90.6% cuando se realizan dos PCR consecutivas (Long et al).

La sensibilidad de la prueba probablemente depende del tipo y la calidad de la muestra obtenida, la duración de la enfermedad en el momento de la prueba y el ensayo específico.

  • Según la muestra: en base al rendimiento de la prueba por tipo de muestra los datos sugieren que la sensibilidad de la prueba puede variar.
    • Las muestras de las vías respiratorias inferiores pueden tener cargas virales más altas que las muestras de las vías respiratorias superiores, mostrando resultados positivos con más probabilidad (Yu et al).Así, en un estudio sobre pacientes con COVID-19 que fueron muestreados en varias localizaciones anatómicas, las tasas más altas de pruebas positivas de ARN viral se informaron en el lavado broncoalveolar (95%) y esputo (72%), en comparación con el frotis nasal (63%) y el orofaríngeo (32%) (Wang et al).
    • Algunos estudios han sugerido que los niveles de ARN viral son más altos y se detectan con mayor frecuencia en las muestras nasales en comparación con las orales (Kujawski A et al.). 
    • En relación a la prueba cuando la muestra la toma el propio paciente, (nasales y saliva), la sensibilidad es similar a la de las muestras nasofaríngeas recogidas por personal sanitario. 
  • Según la duración de la enfermedad: el rendimiento de la prueba y por tanto la probabilidad de que se detecte ARN del SARS-CoV-2 también puede variar según la duración de la enfermedad.

En un interesante análisis de siete estudios Kucirka et al. evaluaron el rendimiento de RT-PCR desde el inicio de los síntomas o la exposición, mostrando las siguientes tasas estimadas de resultados falsos negativos:

  • Día 1 (exposición): 100%
    • Día 5 (estimado como el primer día de síntomas): 38%
    • Día 8: 20%
    • Día 9: 21%
    • Día 21: 66%

Sin embargo, este trabajo presenta la limitación de la heterogeneidad entre los métodos utilizados, pues en algún estudio se utilizó la combinación de RT-PCR y serología de IgM.

  • En otros estudios (Furukawa et al) también se sugiere que los niveles de ARN viral son altos antes del desarrollo de los síntomas, es decir, en pacientes presintomáticos.
  • Los datos sobre el rendimiento del test y los niveles de ARN viral en pacientes asintomáticos son limitados. 
  • Un hecho muy importante que debemos tener en cuenta es que todavía se desconoce qué tan pronto se puede detectar el ARN viral después de la exposición y la infección.
  • Según el tipo de ensayo: están descritas diferencias notables en el límite de detección entre los principales ensayos de PCR comerciales. Además, los tests en el lugar de atención al paciente pueden no ser tan sensibles como aquellos realizados en el laboratorio.

Como resumen, recordemos las cuatro razones que la Sociedad Española de Inmunología (SEI) propone para explicar los resultados falsos positivos:

  1. Las cargas virales en las muestras del tracto respiratorio superior son mucho más bajas que las de las muestras inferiores.
  2. La liberación de cargas virales de pacientes en diferentes etapas de infección varía en un amplio rango.
  3. La recolección de muestras de hisopos de alta calidad requiere de personal cualificado.
  4. Los reactivos de PCR de diferentes fuentes tienen una alta variabilidad.

REFLEXIONES.

El resultado de una prueba -en el caso que nos ha ocupado la PCR, pero que podemos extrapolarla a cualquier otra- no debemos interpretarlo de forma aislada, pues es una prueba complementaria.  Siempre debemos considerar el resultado en el contexto del cuadro clínico, abordando además de forma integrativa los aspectos profesionales y psicosociales del paciente.  

No podemos interpretar un único resultado como categórico, ya que debemos tener en cuenta la enorme variabilidad biológica (entre o tras) del individuo, por lo que se vuelve crucial individualizar cada paciente en todo momento.

Debemos ser especialmente prudentes a la hora de emitir un juicio apoyado solo en una técnica o prueba, cuando a partir de aquí se pueden desprender actuaciones, recomendaciones y abordajes de repercusión epidemiológica, social y sanitaria como en la situación que nos ocupa actualmente.

BIBLIOGRAFÍA.

  • Furukawa et al. Evidence supporting transmission of Severe Acute Respiratoiry Syndrome Coronavirus 2 while presymptomatic or asymptomatic. Emerg Infect Dis.2020;26(7). Epub 2020 Jun 21.
  • Kujawski SA et al. Clinical and virologic characterisitics of the first 12 patients with coronavirus disease (COVID-19) in the United States. 2020. Nat Med:26(6):861. Epub 2020 Apr 23.
  • SEI (Sociedad Española de Inmunoología). Versión 01. 2 de abril de 2020.
  • Wang W et al. Detection of SARS-Cov-2 in different types of clinical specimens. JAMA. 2020 Mar 11;323(18):1843-4. doi: 10.1001/jama.2020.3786. Online ahead of print. PMID: 32159775.
  • Woloshin S, et al. False negative tests for SARS-CoV-2 infection. Challenges and implications. N Engl J Med. 2020. PMID: 32502334.
  • Yu F et al. Quantitative detection and viral load analysis of SARS-Cov-2 in infected patients.  Clin Infect Dis. 2020 Jul 28;71(15):793-798. doi: 10.1093/cid/ciaa345.PMID: 32221523.

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2 comentarios

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Carmen 9 septiembre, 2020 at 17:18

O sea que no sabemos cuánto tiempo deséela aparición de los síntomas o PCR positiva, una persona tiene capacidad de trasmitir la COVID-19

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comcadiz 10 septiembre, 2020 at 9:15

Buenos días,

La duración de la enfermedad es variable, pues depende de la gravedad de la presentación clínica, de tal forma que el tiempo medio desde el inicio de los síntomas hasta la recuperación es de 2 semanas cuando la enfermedad es leve y de 3-6 semanas cuando es grave. El tiempo entre el inicio de síntomas hasta la instauración de síntomas graves es de 1 semana, y de 2-8 semanas hasta que ocurre un desenlace fatal. Hay un porcentaje de personas que describen síntomas prolongados y recurrentes, durante meses, aunque por el momento no hay estudios de cohortes de casos que describan claramente la evolución de la enfermedad.
Basado en los estudios publicados, el tiempo de transmisibilidad del SARS-Cov-2, determinado por PCR y en algunos casos correlacionados con la viabilidad del virus en cultivos celulares, debemos diferenciarlo según la gravedad en la presentación clínica:
– En personas con síntomas leves más allá de la primera semana tras el inicio de síntomas, la probabilidad de transmitir la infección es muy baja, dejando de ser transmisible a los 15 días en los pacientes asintomáticos y casos leves.
– Es poco transmisible a los 21-30 días en los casos graves.
Podemos concluir que, de acuerdo con la evidencia existente, la transmisión de la infección ocurre fundamentalmente en los casos leves en la primera semana de la presentación de los síntomas, desde 2-3 días antes hasta 7-8 días después. En los casos más graves esta transmisión es más intensa y más duradera.

Un saludo
D. Jasson Abel Saldarreaga Marín. Especialista en Microbiología y Parasitología Clínica y en Medicina Familiar y Comunitaria. Vocal de Médicos en Precario y de Médicos en Formación del COMCADIZ

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